神经系统研究工具系列二神经标记上

导读：

神经环路的复杂性是由神经细胞种类的复杂、不同种类神经细胞电生理特征的复杂和不同脑区的不同种类神经细胞连接模式的复杂决定的。因此，如果希望在细胞层次上研究和认识脑功能，就必须结合分子标记和示踪、细胞操纵和干扰等方法，针对特定细胞给予标记。

脑科学研究新技术

病毒载体是神经生物学家常用的、能将遗传物质导入神经元中的工具，可以在体内和体外应用。病毒已经进化出专门的分子机制，能有效地将它们的遗传物质导入到被感染的神经元内。病毒载体功能具有多样性，如跨神经突触顺行或者逆行表达、跨单突触传播、在分化的神经元中复制、携带多种标记物进行遗传等。根据神经元标记的目的，我们可将神经标记划分为神经环路标记、神经分化标记、神经元标记、神经元内细胞器标记四个部分，本期讨论的是神经环路标记和神经分化标记两部分。

神经环路标记

嗜神经病毒是神经环路结构和功能研究中的新生力量，具有以下特点和优势：种类繁多；可以跨突触传播；跨突触方向可控，可特异顺行或逆行传播；病毒跨突触后可复制，信号不衰减；可携带多种标示物；可结合已有的数百种Cre动物品系，对特定类型细胞的神经环路进行高灵敏的可视化。

目前国际上常用于神经环路示踪系统，主要是可分为3大类：

（1）疱疹病毒科的伪狂犬病毒和单纯疱疹病毒；

（2）弹状病毒科的狂犬病毒和水疱炎病毒；

（3）为限制跨突触病毒感染和传播范围的辅助病毒，包括腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒等。

基于这些病毒的结构、感染及复制特性，利用反向遗传学及同源重组等手段，筛选和改造病毒，减弱毒力，插入荧光蛋白等外源基因，初步满足逆向跨单突触和多突触、正向跨多突触传播的示踪系统，成为神经环路研究的有力工具。

年中国科学院深圳先进技术研究院王立平课题组、武汉物理与数学研究所徐富强课题组等合作发表的论文“Processingofvisually-evokedinnatefearbyanon-canonicalthalamicpathway”，揭示了本能恐惧反应神经通路，该通路起源于上丘，经过丘脑枕到达外侧杏仁核。具体为，作者将顺行示踪病毒AAV-CaMkIIa-EYFP注射入上丘中深层脑区，将逆行跨突触嗜神经伪狂犬病病毒EnvA-rabies-mCherry注射入外侧杏仁核脑区，发现在丘脑枕区域同时标记有由上丘中层顺向投射的绿色标记神经元和由外侧杏仁核逆向投射的红色标记神经元（如下图b,c)。作者还利用时间依赖的逆向跨突触嗜神经伪狂犬病病毒注射入外侧杏仁核，观察到上丘神经元被逐步感染。当丘脑枕神经元被破坏时，上丘中深层神经元被感染数量大幅减少（如下图g）。

今年，该团队同样运用嗜神经病毒环路示踪技术证实了负责情绪的杏仁核亚核团到负责记忆的海马区亚核团的单突触联系。通过嗜神经病毒逆向示踪研究显示更多的纤维联系主要是从基底外侧杏仁核后部（BLP）的锥体神经元发出投射到腹侧海马CA1区（vCA1）。具体地，在外侧杏仁核注射顺行示踪病毒AAV5-CaMKIIa-hChR2(ET/TC)-mCherry，在vCA1区发现红色示踪神经元（如下图）。为了证明是单突触投射，作者将Cre依赖的辅助病毒（AAV-EF1a-DIO-GTandAAV-EF1a-DIO-RV-G,1:1;green）注射入Thy1-Cre品系小鼠vCA1脑区，为的是限制伪狂犬病毒跨突触感染。然后在该脑区注射伪狂犬病毒（EnvA-pseudotypedRV-DG-DsRed），结果在BLP脑区检测到DsRed。

神经分化标记

逆转录病毒基因组是随机整合到宿主染色体上。逆转录病毒基因组的整合是复制病毒RNA的必经阶段。只有当被感染细胞处于细胞分裂期，逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此，逆转录病毒只能在分裂细胞内复制，是神经分化标记的主力军。

由于逆转录病毒具有只感染分裂的细胞、能持续表达子细胞中、且能长时间表达等特点，在神经系统中，逆转录病毒被广泛应用于对各类干细胞（如胚胎干细胞、成体干细胞等）的研究。包括对干细胞分裂行为、子细胞的迁移、干细胞产生子细胞的环路等方面的研究。

早在年，美国纽约斯隆凯特琳癌症研究中心时松海课题组在研究突触连接在大脑皮层中的发育形成时，就利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒注射入孕鼠子宫内胚胎鼠的脑室中，在小鼠出生后的各个阶段，观察GFP标记的神经元发育变化。

相似地，在研究辐射状神经胶质样的始祖细胞的分化和迁移过程中，也用到带GFP的逆转录病毒标记该始祖细胞及其分裂的神经元，最终发现了一种新的胚胎期大脑皮层祖先神经元分化类型。该结果由美国加州大学旧金山分校ArnoldRKriegstein课题组于年发表在《NatureNeuroscience》上。

近年来，随着转基因技术的成熟，越来越多的研究人员将loxP品系的转基因小鼠与表达Cre重组酶的逆转录病毒结合使用，从而操控某个基因的活性，比较失活与成活前后的生理变化。

年中科院上海生科院神经科学研究所蒲慕明研究组在分析脑源性生长因子BDNF与成年新生神经元树突发育关系时用了逆转录病毒，揭示了调控新生神经元树突发育的分子机制。具体为，将表达Cre重组酶和GFP的逆转录病毒注射入成年BDNF敲除转基因小鼠（BDNFf/f）海马脑区（如下图G），图B-D显示GFP表达的树突棘发育显著受损，与野生对照组相比树突长度明显较短，树突棘数量明显减少。作者同时将表达Cre和GFP的逆转录病毒和只表达mCherry的逆转录病毒注射入BDNFf/f小鼠海马脑区，同时得到BDNF敲除的GFP标记新生神经元和BNDF正常表达的mCherry标记新生神经元（如下图E）。两周后，GFP标记的神经元即BDNF缺失神经元，其树突长度和枝干数量明显短于和少于mCherry标记的神经元（如下图F）。在野生型小鼠也做同样操作，两种蛋白标记的神经元间没有明显形态学差异。所以证实了脑源性神经生长因子BDNF在成年新生颗粒细胞树突发育中的作用。

下期预告

　　神经系统研究工具系列（二）

神经标记（下），敬请期待！

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